生物活性材料Col-Tgel对人组织干细胞的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0713

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (10): 1540-1546.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0713

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生物活性材料Col-Tgel对人组织干细胞的作用

尹秀秀，胡林萍，朱才英，张孝兵，程涛

实验血液学国家重点实验室，中国医学科学院血液病医院血液学研究所，中国医学科学院干细胞医学中心，北京协和医学院干细胞与再生医学系，中国医学科学院暨北京协和医学院，天津市 300020

收稿日期:2017-11-13 出版日期:2018-04-08 发布日期:2018-04-08
通讯作者: 程涛，教授，中国医学科学院血液病医院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，天津市 300020
作者简介:尹秀秀，女，1990年生，山东省德州市人，汉族，北京协和医学院在读博士，主要从事造血干细胞调控与造血微环境异常研究。
基金资助:
国家重点研发计划项目(2016YFA0100600)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2016-I2M-1-017)；国家自然科学基金项目(81400150，81570164)；创新研究群体科学基金项目(81421002)；协和青年基金和中央高校基本科研业务费专项资金项目(3332016090)

Effects of Col-Tgel, a bioactive material, on human tissue stem cells

Yin Xiu-xiu, Hu Lin-ping, Zhu Cai-ying, Zhang Xiao-bing, Cheng Tao

State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China

Received:2017-11-13 Online:2018-04-08 Published:2018-04-08
Contact: Cheng Tao, Professor, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China
About author:Yin Xiu-xiu, Doctoral candidate, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China
Supported by:
the National Key Research and Development Program of China, No. 2016YFA0100600; CAMS Initiative for Innovative Medicine, No. 2016-I2M-1-017; the National Natural Science Foundation of China, No. 81400150, 81570164; the Science Foundation for Innovation Research Groups, No. 81421002; the Youth Foundation of PUMC and the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 3332016090

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

生物活性材料Col-Tgel：是一种凝固过程可控制的胶原基水凝胶，它在液体状态下包裹细胞，凝固后则形成交联网络，使细胞分散于其中，由于它是一种含水凝胶，营养物质可以自由进出，故可使分散于其中的细胞得到充足的营养，形成类似于体内生理微环境的三维培养体系，弥补了传统二维细胞培养体系的不足之处。

摘要

背景：虽然传统的人干细胞二维平面培养体系操作简便，但并不能真正模拟体内的三维生理微环境，不利于进行人干细胞生物学行为研究。

目的：为构建一种可为细胞生长增殖提供类似于体内生理环境的三维培养体系，观察生物材料Col-Tgel对人造血干细胞和人间充质干细胞生物活性的影响。

方法：①体外共培养实验：三维培养组，将绿色荧光蛋白标记的人间充质干细胞与人脐带CD34⁺细胞直接接触共培养于生物材料Col-Tgel中；单独培养组，将人脐血CD34⁺细胞培养于生物材料Col-Tgel中；二维培养组，将绿色萤光蛋白标记的人间充质干细胞与人脐血CD34⁺细胞共培养于transwell小室；对照组，常规培养人脐血CD34⁺细胞。培养3 d后，流式细胞仪检测各组CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞比例，同时对直接接触培养组进行原位免疫荧光染色；②体内移植实验：采用X射线照射NOD/SCID小鼠，照射后24 h分2组治疗，实验组于胫骨骨髓腔移植绿色荧光蛋白标记的人间充质干细胞-生物材料Col-Tgel溶液，对照组移植绿色荧光蛋白标记的人间充质干细胞-PBS溶液，移植3 d后进行移植侧胫骨标本双光子/共聚焦显微镜检测。

结果与结论：①体外实验：三维培养组CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞扩增倍数为二维培养组的2.8倍，说明在生物材料Col-Tgel中培养的间充质干细胞促进了CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的扩增；三维培养组CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞扩增倍数较单独培养组增加4.5倍，较对照组增加1.5倍；免疫荧光染色显示，人间充质干细胞与人脐血CD34⁺细胞可在生物材料Col-Tgel中存活；②体内实验显示，两组均可见存活的人间充质干细胞；③结果表明，生物材料Col-Tgel可为人干细胞生长及增殖提供类似于体内微环境的三维体系。

ORCID: 0000-0003-2322-1589(尹秀秀)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, Col-Tgel, 干细胞, 造血干细胞, 间充质干细胞, 体外共培养, 原位免疫荧光染色, 增殖, 移植, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The traditional two-dimensional culture system has been widely used in the in vitro culture of human tissue stem cells, but it cannot really simulate the three-dimensional physiological microenvironment in the body, which is not conducive to the study of the biological behavior of human stem cells.

OBJECTIVE: To detect the effect of the bioactivity of Col-Tgel in human hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro and in vivo, by constructing a three-dimensional culture system stimulating the physiological microenvironment of the body.

METHODS: (1) In vitro co-culture: Green fluorescent protein labeled MSCs (MSCs-GFP) and human umbilical cord blood CD34⁺ cells were co-cultured in Col-Tgel for 3 days (three-dimensional culture group). Human umbilical cord blood CD34⁺ cells were cultured in Col-Tgel for 3 days as single culture group. MSCs-GFP and human umbilical cord blood CD34⁺ cells were co-cultured in Transwell chamber for 3 days as two-dimensional culture group. Human umbilical cord blood CD34⁺ cells were cultured routinely as control group. The percentage of CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺ cells in each group was measured by flow cytometry. In situ immunofluorescence staining was used to detect the activity of cells that were co-cultured in Col-Tgel. (2) In vivo transplantation: NOD/SCID mice subjected to 24-hour X-ray irradiation were divided into two groups: in experimental group, MSC-GFP cells were resuspended in Col-Tgel and transplanted into the tibia of NOD/SCID mice; in control group, MSCs-GFP were resuspended in PBS and transplanted into the tibia of NOD/SCID mice. The MSC-GFP growth in the bone marrow was detected by two-photon/confocal microscopy at 3 days post transplantation.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) After co-culture in Col-Tgel for 3 days, the percentage of CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺ cells in the three-dimensional culture group was 2.8 times that of the two-dimensional culture group, indicating that the MSCs significantly promoted the expansion of CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺ cells in the Col-Tgel. The percentage of CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺ cells in the three-dimensional culture group was increased by 4.5 times compared with the single culture group and increased by 1.5 times compared with the control group. Immunofluorescence staining showed that the cell viability of human MSCs and human umbilical cord blood CD34⁺ cells was not affected after co-cultured in Col-Tgel for 3 days. In the in vivo transplantation experiment, MSC-GFP cells could survive in the medullary cavity. In summary, Col-Tgel provides a new strategy for stem cell culture and in vivo growth by forming a three-dimensional system similar to the physiological environment in vivo.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Hydrogel, Hematopoietic Stem Cells, Mesenchymal Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

尹秀秀，胡林萍，朱才英，张孝兵，程涛. 生物活性材料Col-Tgel对人组织干细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(10): 1540-1546.

Yin Xiu-xiu, Hu Lin-ping, Zhu Cai-ying, Zhang Xiao-bing, Cheng Tao. Effects of Col-Tgel, a bioactive material, on human tissue stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(10): 1540-1546.

图/表（结果） 6

2.1 脐带间充质干细胞体外培养、感染及流式细胞术分析结果普通光学显微镜下观察体外培养的脐带间充质干细胞，贴壁生长的脐带间充质干细胞大多数为多角形或梭形，呈漩涡状排列生长。反转录病毒感染24 h后，在荧光显微镜下可观察到发出绿色荧光的细胞，感染48 h后绿色荧光蛋白表达强阳性，经过细胞传代培养后仍可见较强荧光。用流式细胞术分选绿色荧光蛋白标记细胞，获得绿色荧光蛋白标记脐带间充质干细胞细胞株并继续传代培养，其绿色荧光蛋白标记细胞纯度可达95%以上(图1A)。荧光显微镜下显示，该细胞株的绿色荧光较强(图1B)。

2.2 Col-Tgel对细胞体外培养活性的影响三维培养组培养3 d后，显微镜下观察显示两种细胞均存活且状态较好(图2A)，荧光显微镜下显示人脐带间充质干细胞发出绿色荧光(图2B)。用胰酶消化Col-Tgel中的细胞，标记表面人抗体CD34，流式检测结果显示，Col-Tgel中同时有CD34⁺细胞和绿色荧光蛋白标记的脐带间充质干细胞(图3)，说明在体外Col-Tgel对人脐带间充质干细胞和CD34⁺细胞无毒性，两种干细胞均可在Col-Tgel中进行体外培养。原位免疫荧光染色进一步验证了该结果(图4)。以上研究结果表明，在体外培养中，Col-Tgel不影响人脐带间充质干细胞和CD34⁺细胞的活性。

2.3 Col-Tgel在体外对人脐血CD34⁺细胞增殖的影响单独培养组、三维培养组及对照组的CD45⁺CD34⁺细胞比例分别为(75.53±1.63)%、(74.40±0.38)%、(82.87±0.75)%，各组之间无差异(P > 0.05)；CD34⁺CD38^-细胞比例分别为(6.51±0.67)%、(7.08±0.07)%、(9.78±0.18)%，单独培养组及三维培养组均较对照组明显下降(P < 0.05)；三维培养组CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞(长期造血干细胞)比例为(1.88±0.10)%，是单独培养组(0.32±0.11)%的5.9倍，但较对照组长期造血干细胞的比例增加不明显(图5A，B)。以上各组细胞的绝对数结果显示，三维培养组长期造血干细胞较单独培养组增加4.5倍，较对照组增加1.5倍(图5C)，说明使用Col-Tgel对人脐带间充质干细胞和CD34⁺细胞进行共培养，可提高长期造血干细胞扩增数。三维培养组与单独培养组细胞总数、CD45⁺CD34⁺细胞扩增倍数和CD34⁺CD38^-细胞扩增倍数在两种不同培养方式中并没有明显差异，但三维培养组长期造血干细胞的扩增倍数是二维培养组的2.8倍(图5D，E)，说明相比于液体共培养，在Col-Tgel中人脐带间充质干细胞和CD34⁺细胞进行共培养更有利于长期造血干细胞的扩增。

2.4 Col-Tgel对移植入体内脐带间充质干细胞活性的影响实验组和对照组均有绿色荧光蛋白标记脐带间充质干细胞生长(图6)，说明Col-Tgel并不影响人脐带间充质干细胞在小鼠体内(髓腔中)的存活，对移植入体内的细胞的活性没有影响。

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引言

造血干细胞是一类多能干细胞，具有不断自我更新的能力和分化为各种成熟血细胞的潜能，是成体脊椎动物血细胞的原始细胞^[1]。造血干细胞移植目前已被广泛应用于白血病、淋巴瘤等多种恶性血液病的治疗，并逐渐扩展到其他实体瘤、自身免疫性疾病、糖尿病等非血液系统疾病的治疗中去^[2]。但是，临床上造血干细胞来源有限，且移植后在患者体内有效造血重建率较低，这些均限制了造血干细胞的临床应用，因此常需要体外培养造血干细胞来研究其生物学行为，以克服来源不足和低植入率等障碍。

间充质干细胞是一类多能干细胞，具有无限增殖能力和多向分化潜能，经过诱导分化能够形成至少一种类型的高度分化的子代细胞^[3]。骨髓中的间充质干细胞起源于胚胎发育早期的中胚层和外胚层^[4]，在一定条件下可诱导分化为骨组织、软骨组织和脂肪组织等多种中胚层来源的组织，并可作为这些组织损伤后修复的种子细胞^[5]，是当前备受世界各地科学研究者关注的一类具有可塑性的成体干细胞。有许多研究发现，骨髓间充质干细胞还能够促进造血干细胞移植后的恢复和植入，提高移植率^[6]。然而，不容忽视的是间充质干细胞同时还有许多不利之处，它不仅可促进肿瘤的生长和转移，本身也具有恶变成瘤的风险^[7]。除此之外，骨髓间充质干细胞来源有限，体外扩增易老化，不能达到临床所需要的细胞数量，并且存在伦理问题，这些原因都使得间充质干细胞的临床应用受到约束。因此，不断通过体内外实验研究间充质干细胞的生物学特性，是解决这些问题的关键所在，而一个好的培养体系是解决这些问题的基础。

传统的干细胞培养主要依赖于二维平面培养，因其操作简单方便，长久以来被广泛应用于人组织干细胞的体外培养。然而，大家都知道，成体脊椎动物的造血干细胞主要存在于骨髓腔中，造血干细胞的自我更新及分化和其赖以生存的造血微环境密切相关^[8]。骨髓造血微环境是由成骨细胞^[9]、血窦内皮细胞和血管周围网状细胞^[10]、间充质干细胞^[11]、神经细胞^[12]、脂肪细胞^[13]、巨核细胞^[14]、破骨细胞及细胞外基质等多种成分构成的三维空间结构^[15-16]。因此，一直以来被广泛应用于干细胞培养的二维平面培养体系，无论是在三维空间结构方面，还是在组成成分方面(包括与细胞增殖分化等生物学行为密切相关的各种细胞因子及信号调节分子的添加、细胞外基质成分的有无等)，都无法真正模拟体内的三维造血微环境，因而在传统的二维平面培养体系中，干细胞的增殖、分化等生物学行为和形态学方面都可能与生理状态存在差异^[17]。Col-Tgel是一种凝固过程可控制的胶原基水凝胶，可在室温下操作。Col-Tgel在液态时包裹细胞，经过交联反应后形成固体产物，它提供的胶原骨架可使细胞分散黏附于其中并呈三维状态生长，更好地模拟了体内环境，形成真正意义上的三维培养体系。为了更好地模拟骨髓微环境，实验以Col-Tgel为基础，构建了一种可为细胞的生长增殖提供类似于体内生理环境的三维培养体系，为干细胞体外培养和体内生长研究提供新策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞生物学体外培养实验和小鼠体内移植实验。

1.2 时间及地点实验于2016年3至12月在中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)血液学国家重点实验室完成。

1.3 材料新鲜人脐血均采自天津市中心妇产医院健康足月剖宫产新生儿，脐血量为80-120 mL/袋。所有产妇及家属均签署知情同意书。脐带间充质干细胞由中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)血液学国家重点实验室提供。Col-Tgel水凝胶购于北京唯辉生物技术有限公司。

实验动物：实验所涉及到的6-8周龄雌性NOD/SCID小鼠均由中国医学科学院实验动物研究所提供，体质量18-22 g，饲养于中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)SPF级无菌动物房内，其饲料、饮水及垫料均经过高压灭菌。所有实验涉及到的小鼠均得到中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)动物室的管理与批准。

实验主要试剂：实验所涉及到的人脐带血CD34⁺细胞分选试剂盒购于德国Miltenyi Biotec公司；所使用的流式抗体有人单克隆抗体CD45RA-APC-H7、人单克隆抗体CD45-PE-Cy7、人单克隆抗体CD34-APC、人单克隆抗体CD38-PE-Cy7、人单克隆抗体CD90-Percp-Cy5.5、人单克隆抗体CD49f-PE及小鼠单克隆抗体CD45-APC-Cy7，DAPI染料，均购于美国BD Bioscience公司；Accutase细胞消化液购于Biolegend；实验所涉及到的反转录病毒载体由程涛教授原美国匹兹堡大学实验室构建，该反转录病毒载体的包装体系为pMSCV-GFP，包装细胞系为Phoenix细胞株；Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司；免疫荧光染色所涉及到的Rabbit anti-human CD34单克隆抗体，Goat anti-rabbit-PF555荧光二抗购于Life Technologies公司；人CD34⁺细胞培养基IMDM购于Life Technologies公司。

实验主要仪器：LSR Ⅱ流式细胞分析仪、AriaI Ⅱ流式细胞分选仪购于美国Becton Dickinson公司；MACS separator for MS or LS column购于德国Miltenyi Biotec公司；分光光度计(NANODrop 1000 Spectropho-tometer)购于美国Thermo Scientific公司；倒置相差显微镜、荧光显微镜均为日本Nikon公司产品；FV1200MPE双光子/共聚焦显微镜购于Olympus公司。

1.4 实验方法

1.4.1 反转录病毒制备及间充质干细胞感染消化对数生长期的Phoenix细胞，离心后用新鲜培养基重悬，接种于10 cm平皿中，在37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱内培养，当细胞长达到80%-90%汇合度时进行转染实验：用绿色荧光蛋白标记的反转录病毒载体进行细胞转染，具体操作步骤参照Lipofectamine 2000说明书；转染48 h后收集新鲜病毒上清，用0.45 μm的滤器过滤后高速离心浓缩；将反转录病毒加到已准备好的脐带间充质干细胞中进行感染，以不加病毒的脐带间充质干细胞作为对照组，在饱和湿度的37 ℃、体积分数5%CO₂、体积分数5%O₂的低氧培养箱内培养8 h后，换掉含病毒的培养基，加新鲜培养基后连续培养48 h；消化病毒感染的间充质干细胞，流式细胞术分选绿色荧光蛋白标记的间充质干细胞，继续培养。

1.4.2 人脐血CD34⁺细胞的富集将新鲜脐血加到无菌血浆瓶中，按脐血与羟乙基淀粉5∶1的比例加入羟乙基淀粉，沉降脐血中的红细胞，至少45 min；小心吸取上清有核细胞，用2-4倍体积的红细胞裂解液常温裂解红细胞 15 min后，1 500 r/min离心10 min；弃上清，观察红细胞裂解情况，用40 mL裂解红再次常温裂解10 min，1 500 r/min离心10 min；加入PBS-EDTA缓冲液洗涤2次，1 500 r/min离心5-8 min；弃上清后，每10⁸细胞用300 μL的PBS-EDTA缓冲液重悬；每10⁸细胞加入100 μL Fc-R阻断剂，避光；每10⁸细胞再加入100 μL的CD34⁺Microbeads，充分混匀后4 ℃避光孵育30 min；孵育结束后，每10⁸细胞用20 mL PBS-EDTA缓冲液洗1遍，1 500 r/min离心5 min，弃上清；每10⁸细胞用500 μL PBS-EDTA缓冲液重悬；安装LS柱， 3 mL缓冲液润柱1遍；逐滴加入细胞悬液，梯度磁场中通过；3 mL PBS-EDTA缓冲液洗柱3遍；将柱子移除磁场放在收集管上，加入3.0-4.0 mL PBS-EDTA缓冲液，用活塞快速推出细胞CD34⁺细胞。将收集到的CD34⁺细胞以1× 10⁹ L^-1的细胞浓度进行冻存，保存于液氮中。

1.4.3 体外共培养实验

实验分组：①三维培养组，取Accutase消化培养的绿色荧光蛋白标记脐带间充质干细胞，复苏冻存的人脐血CD34⁺细胞，将二者分别以2.5×10⁵和2.5×10⁴的细胞数重悬在50 μL Col-Tgel中，接种于48孔板中，37 ℃孵育 45 min，待Col-Tgel凝固后，在Col-Tgel表面覆盖干细胞完全培养基IMDM(含体积分数10%胎牛血清、100 μg/L干细胞生长因子、100 μg/L FMS样酪氨酸激酶3配体、50 μg/L促血小板生成素)，500 μL/孔，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中共培养；单独培养组，将CD34⁺细胞单独培养在Col-Tgel中，2.5×10⁴/孔，37 ℃孵育45 min，待Col-Tgel凝固后，在Col-Tgel表面覆盖干细胞完全培养基IMDM(含体积分数10%胎牛血清、100 μg/L干细胞生长因子、 100 μg/L FMS样酪氨酸激酶3配体、50 μg/L促血小板生成素)，500 μL/孔，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中共培养，每组设3个复孔；②二维培养组(液体共培养)，将绿色荧光蛋白标记脐带间充质干细胞铺于24孔板中，次日观察细胞汇合度达95%以上，弃掉间充质干细胞培养基，加上干细胞完全培养基，300 μL/孔，放置transwell后，加入 200 μL干细胞完全培养基重悬的CD34⁺细胞，5×10⁴/孔；对照组为单独CD34⁺细胞培养，5×10⁴/孔，每组设3个复孔。

流式细胞仪检测：培养3 d后收集各组(二维培养组上室)中的细胞进行计数，流式细胞仪分别检测各组CD34⁺、CD34⁺CD38^-、CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的比例。

体外共培养后原位免疫荧光染色：培养3 d后做原位免疫荧光染色，首先用体积分数4%甲醛固定，室温15 min。PBS洗涤2遍后，用4%Donkey serum室温下封闭30- 45 min。Rabbit anti-human CD34单克隆抗体(1∶50稀释)，200 μL/孔，4 ℃过夜孵育。PBS洗涤3遍后，Goat anti-rabbit IgG荧光二抗(1∶200稀释)，200 μL/孔，室温避光孵育45 min。PBS洗涤3遍，DAPI染色后用荧光显微镜下观察，拍照。

1.4.4 体内移植实验取6只6-8周龄NOD/SCID小鼠，进行X射线照射(剂量2.0 Gy，剂量率1.2 Gy/min)，照射后24 h内经胫骨进行髓腔移植，实验组移植绿色萤光蛋白标记的人间充质干细胞-生物材料Col-Tgel溶液，对照组移植绿色荧光蛋白标记的人间充质干细胞-PBS溶液，移植细胞数1×10⁶/胫骨，3只/组。小鼠在照射前1周及移植后给予抗生素。移植后3 d，脱颈处死小鼠，取髓腔移植的胫骨进行冰冻切片，6 μm/片，进行免疫荧光染色。首先用4%Donkey血清封闭非特异性位点，室温30 min；标记一抗Rabbit anti-mouse Laminin，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3遍后，标记二抗Goat anti-Rabbit IgG，室温避光孵育45 min；PBS洗涤3遍后，Mounting-DAPI封固，用双光子/共聚焦显微镜检测人脐带间充质干细胞在骨髓中的生长情况。

1.5 主要观察指标体外实验中，细胞培养3 d后，流式细胞分析和原位免疫荧光染色法检测细胞活性；体内实验中，人脐带间充质干细胞在骨髓中的生长情况。

1.6 统计学分析实验数据以x(_)±s表示，应用GraphPad Prism 6软件进行统计学分析，两样本均数比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

传统的二维平面培养体系由于简单方便被广泛应用于造血干细胞的体外扩增等生物学行为的研究^[19]，但是这种二维培养体系并不能真正模拟体内的三维造血微环境^[20]。为了更好地模拟骨髓微环境，越来越多的研究者开始将广泛应用于实体肿瘤和组织再生的三维培养体系用于造血细胞体外研究^[21]。在此次研究中，采用一种生物材料Col-Tgel对干细胞进行了一系列实验。Col-Tgel是一种凝固过程可控制的胶原基水凝胶，可在室温下操作。Col-Tgel在液态时包裹细胞，经过交联反应后形成固体产物，它提供的胶原骨架可使细胞分散黏附于其中并呈三维状态生长，更好地模拟了体内环境，形成真正意义上的三维培养体系^[22-23]。

此外，Col-Tgel是含水凝胶，含有细胞生存所必须的营养物质，还能使营养物质自由地进出，使分散于其中的细胞都能得到营养，同时还可交联生物活性因子，调节细胞的生长和分化^[23-24]，为细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间相互作用的研究提供了一个稳定的研究平台。

此次研究中，首先利用流式细胞术和免疫荧光染色方法验证了Col-Tgel对干细胞无毒性，脐带间充质干细胞和CD34⁺细胞可在Col-Tgel中存活。还对比了脐带间充质干细胞和CD34⁺在Col-Tgel中共培养和在传统二维培养体系中共培养3 d的结果，发现在Col-Tgel中共培养后，长期造血干细胞扩增倍数是在传统二维培养体系中的2.8倍，说明

相比于传统二维培养体系，在Col-Tgel中的脐带间充质干

细胞更有利于长期造血干细胞的增殖。以上研究结果表明，脐带间充质干细胞和CD34⁺细胞不仅可在Col-Tgel中维持良好的生长状态，而且Col-Tgel将人脐带间充质干细胞和CD34⁺细胞局限在一个集中的环境中，使脐带间充质干细

胞和CD34⁺细胞在空间上距离更近，接触时间更长，共培养过程中，脐带间充质干细胞分泌的细胞因子能更充分地支持CD34⁺细胞的生长。因此，该体系克服了传统二维培养体系的缺点，为人造血干细胞的体外研究提供了更好模型。

大量研究表明，脐带间充质干细胞不仅可在体外长期培养体系中有效支持人CD34⁺细胞生长，将其与人异基因造血干细胞共同移植，还可促进人造血干/祖细胞的植入^[21^，^25]。因此，在研究中常将脐带间充质干细胞与CD34⁺细胞共同移植，以提高植入率^[21^，^25]。Col-Tgel是用天然的生物大分子制备的，不但具有良好的生物相容性，且易于降解吸收^[26]，因此可用于体内实验。此次研究将绿色荧光蛋白标记脐带间充质干细胞用Col-Tgel重悬后进行髓腔移植，可在双光子/共聚焦显微镜下观察到存活的绿色荧光蛋白标记脐带间充质干细胞，说明Col-Tgel对移植入体内的细胞的活性没有影响，该研究结果为Col-Tgel用于脐带间充质干细胞和CD34⁺细胞髓腔共移植研究提供了实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

生物活性材料Col-Tgel对人组织干细胞的作用

Effects of Col-Tgel, a bioactive material, on human tissue stem cells

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